酶聯(lián)免疫檢測技術（elisa試劑盒檢測方法）是20世紀60年代末期發(fā)展起來的一種免疫學檢測方法，是目前zui廣泛應用的標記免疫技術。1966年Nakene和Pierce共同發(fā)表了《酶標抗體：制備和抗原定位中的應用》，首先提出了酶聯(lián)免疫技術（ELISA試劑盒檢測方法）的基本原理。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表《ELISA KIT方法吸附試驗測定IgG含量》一文，使酶聯(lián)免疫（ELISA試劑盒檢測）技術成為一種實用的檢測液體標本中微量物質(zhì)的方法。目前酶聯(lián)免疫（ELISA試劑盒）檢測技術已廣泛用于免疫學、微生物學、寄生蟲學等。由于其具有靈敏度高、試劑穩(wěn)定、設備簡單、操作安全等優(yōu)點，近幾年也將其應用到食品領域中來檢測某些食品中的生理活性物質(zhì)。

一、基本概念

1、免疫：籠統(tǒng)地概括起來，免疫就是人和動物機體防御、排除外來物質(zhì)（異物）進人體內(nèi)，同時識別和清除體內(nèi)死亡、變性物質(zhì)和平定體內(nèi)叛亂分子突變細胞，以保護和穩(wěn)定自身的防護機制。

2、抗原：抗原是指那些能夠誘導機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，產(chǎn)生抗體和致敏效應淋巴細胞，并在體內(nèi)外與之特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應的物質(zhì)。

3、抗體：是能與相應的抗原專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，和機體其他生物大分子一樣是細胞的產(chǎn)物，分泌到體液中或表現(xiàn)在細胞表面上。

4、抗原、抗體反應：抗原和抗體在體外的反應亦稱血清學反應。這類反應可借助免疫學方法進行檢測。

二、抗體定量檢測方法及其原理

定量分析抗體的常用方法有擴散法、酶聯(lián)免疫吸附法和火箭免疫電泳法等。

1、免疫擴散法

a、單向免疫擴散法

原理：將待檢抗原滴加于含相應抗體的瓊脂板小孔中，經(jīng)一定時間擴散后。形成乳白色的沉淀壞，在一定濃度范圍內(nèi)，抗原的含量與沉淀壞直徑成正比?？梢韵扔眉褐煌瑵舛鹊臉藴士乖瞥蓸藴是€，再根據(jù)測試樣品沉淀環(huán)直徑的大小，從標準曲線上查出樣品中抗原的相應含量。

b、雙向免疫擴散法

原理：可溶性抗原與已知可溶性抗體分別加入相鄰的瓊脂糖凝膠板上的小孔內(nèi)，在電解質(zhì)存在下讓它們相互向?qū)Ψ綌U散。當兩者在zui適當比例處相遇時，即形成一條清晰的沉淀線。根據(jù)稀釋度與已知標準品稀釋度之比，可計算出抗體含量。

2、火箭免疫電泳法

原理：抗原在電場力的作用下向前移動，當抗原在通過含有一定量單一抗體的瓊脂凝膠時，即形成抗原抗體復合物，比例合適即沉淀下來。因抗體遷移率低，而抗原隨電泳向前移動，因而使抗原、抗體形成圓錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，峰的高度與抗原的濃度呈正比。

3、酶聯(lián)免疫吸附法（（ELISA）

　　原理：ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測杭原。其基本原理是采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）； ②酶標記的抗原或抗體（標記物）； ③酶作用的底物（顯色劑）。

　　ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體, 再加相應酶標記抗體，抗原--待測抗體--酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。

　　根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有以下三種類型的常用方法：

a、間接法  此法是測定抗體zui常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體。加人待檢標本（含相應抗體）與之結(jié)合。洗滌后，加人酶標抗球蛋白抗體（酶標抗抗體）和底物進行測定。

b、雙抗體夾心法  此法常用于測定抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加人待檢標本（含相應抗原）與之結(jié)合。溫育后洗滌，加人酶標板中。

c、競爭法  此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體。加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原，使二者竟爭與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，zui后結(jié)合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關。

三、酶聯(lián)免疫吸附法測定抗體含量（競爭法）

1、儀器設備

酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio－550）；酶標板 （96孔）；微量注射器。

2、試劑

a、HRP標記羊抗兔Ig G（1:1 000，國產(chǎn)）；標準牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；

b、包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸餾水稀釋至100 mL。 

c、稀釋液與洗滌液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸餾水加至1000mＬ。

d、封閉液：含0.1%明膠0.01mol/L PBS， pH7.4。

e、鄰苯二胺底物溶液（臨用前配制）：臨用前將Na2HPO4·12H2O 2.9g,檸檬酸0.51g溶于100mL蒸餾水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。

f、終止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸餾水中加入98%濃硫酸76mL混均即可。

3、操作方法

a、將抗原結(jié)合在酶標板上。取標準IgG（10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋，得到濃度為0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加標準抗原的兩孔為對照，為反應的0%值，將反應板于4℃放置一夜（8個樣品，分3個平行，4個100%值孔；共28+2孔）。

b、標準牛IgG與初級抗體一兔抗牛血清的反應。將標準IgG（10mg/mL）用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標準牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀釋好的200μL的兔抗牛血清中，其中4個不加標準牛IgG作為測量時的100%值。4℃反應放置一夜。

c、封閉板。將包被好的酶標板孔內(nèi)液體傾去，進行洗滌，各孔加200μL洗滌液后室溫下放置1min，倒掉，如此重復4次后，在吸水紙上拍干，加封閉液進行封閉，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封閉液）。封閉后，如前述洗滌。

d、向酶標板中加人標準抗原和抗體的混合物。將標準牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶標板孔內(nèi)，同是4個未加抗原的100%值的平行樣也加入酶標板中。37℃放置2h，再洗板4次。

e、加人HRP標記的羊抗兔Ig G。洗滌后每孔加100μL稀釋好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗滌。

f、加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗處反應20min后，每孔加人50μL結(jié)束反應液以終止反應。

g、吸收測定。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長為492nm下的吸光值。

h、數(shù)據(jù)處理。標準曲線是以Ig（標準牛IgG含量）對B/Bo作圖，求得線性方程。其中，C為標準牛IgG含量；B為不同濃度標準牛IgG吸收值與0%吸收值之差;Bo為100吸收值與0%吸收值之差。

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